Etter å ha spilt i flere skolestykker droppet Jonathan Lee Miller ut av high school som 17-åring for å bli skuespiller. Hans første storfilm var actiondramaet "Hackers" (1995), der han spilte mot Angelina Jolie. De giftet seg i 1996, og holdt sammen til 1999.

I 1996 spilte han i kultfilmen "Transpotting", og siden har han vært å se i Oscarnominerte "Afterglow" (1997) og sci-fi-filmen "Æon Flux" (2005). I 2011 ble han nominert til beste skuespiller under Screen Actors Guild Awards sammen med resten av gjengen i "Dexter".

Lee Miller har eierskap i produksjonsselskapet Natural Nylon sammen med blant andre Ewan McGregor og Jude Law.